鹿児島大学 遺伝子実験部門

BigDyeXを利用されてうまくいったり、全くうまくいかなかったりすることがあります。
以下は施設ML genetで流れた情報です。参考にしてみてください。

1. 一つは
   ボルテックスの強さが不足していることです。
   遺伝子実験施設ではTUPLEMIXER TWIN3-28N(IWAKI)を使用しています。事実、ボルテックスの強さが不足していたために読めなかったところがあり、当施設のものを使用すると読めるようになった事例があります。当施設のボルテックスを試験的に使いたい方は3F RNA実験室にありますのでご利用下さい。

   もう一つが
   「通常のチップを使用すると径が細すぎるためビーズが十分摘出できない」
   という可能性です。
   施設でもBigDyeXを使用して解析するのですが、蛍光強度が1,000オーバーすることもあれば、150程度になることが多々あります。その要因はこれだったのかも知れません。
   是非お試し下さい。

2. X-terminatorに関しまして1/4プロトコールで行なう際の注意点を聞きましたのでお知らせします。

   BigDye XTerminator 精製キットの利用方法は、以下を参照ください。

   A
   BigDye Terminator3.1 1/4量と5X Bufferを用いて反応ボリューム20uLでシーケンス反応を行う場合は、プロトコール通りの使用量で精製します。この場合の添加量は、以下になります。

   反応済みサンプル 20uL
   SAM溶液 90uL
   Xterminator溶液 20uL

   B
   BigDye Terminator3.1 1/4量で反応ボリュームも1/4の5uLでシーケンス反応を行う場合は、BDXの使用量も1/4にします。
   この場合の添加量は、以下になります。

   反応済みサンプル 5uL
   SAM溶液 22.5uL
   Xterminator溶液 5uL

   3130等BDX専用モジュールを使いランニングする場合に、Bの条件で精製すると溶液量が少ないためサンプルインジェクションが行われなくなります。
   この場合は、5X Bufferを用いて反応ボリューム20uLで反応することをお勧めいたします。（Aの条件）
   反応系の変更が難しい場合は、反応後サンプルに水15uLを加えAの条件で精製してください。

   ポイント：
   BigDye Terminator3.1 1/4量で反応する場合は、攪拌時間を短くしたほうが良い結果が得られることがあります。
   10-20分程度の短い攪拌時間でもテストしてください。

   重要：
   ボルテックスミキサーで攪拌する時は、96well Plateもしくは0.2mLチューブを使います。
   1.5mL等のチューブなどでは攪拌効率が変わるため問題が起こります。（精製不良やシグナル低下）