鹿児島大学 遺伝子実験部門

DNAシークエンス受託解析 Premixサービスについて

Posted on November 9, 1978 in DNAシークエンス

利用については指導教員の承諾を受け、Webform(e-mail)で申し込みを行います。申請の受付後、サンプルをお持ち下さい。
　
　
● サービス概要

・受託サンプル数は8サンプル単位です。端数は次の単位数に合わせて請求いたします。

・DNAシークエンス解析サービスは月・水・木の週3回実施しています。データの送信は通常解析日の翌日(火・木・金)です。(但し、業務の都合により結果送信が遅れることもあります)　保留

・ABI3500xl Genetic Analyzer(キャピラリー24本タイプ)を使用します。
・約2.3時間の泳動で約800塩基(シークエンス反応が良好の場合)読むことができます。

・サイクルシークエンス反応及び泳動操作はすべて施設スタッフが行います。

・申請は”Webform”をご利用下さい(学内のみアクセス可能)。
　●DNAシークエンス受託解析 Premixサービス利用申請_16sample以下
　●DNAシークエンス受託解析 Premixサービス利用申請_17samples以上
　●DNAシークエンス受託解析 Premixサービス利用申請_17samples以上_Excel用

・要領に従い必要事項を記入し、確認ボタンを押すと確認画面になります。確認後、送信を押すと管理室宛にe-mailが送信されます。
・申請の受付後、解析を開始する予定日をお知らせします。解析日に合わせてサンプルをお持ち下さい。解析日の指定はできません。
・解析の順番は先着順となります。

　　申請→解析日確認→提出 の流れを守って下さい。

・解析終了後、e-mailでデータを圧縮後添付して送信します。

● 提出サンプルについて

・0.2µlの8連チューブで提出して下さい。

・画像のように「申請者のアルファベット3文字」と「通し番号」を記入します。　　[ ex. 田浦＞ TAU ] ・端数がある場合でも8連チューブは切らずに提出して下さい。
　
　

　
● 調製について

・各自の研究室での準備

・サイクルシークエンスに使用するTemplateは精製済みのものを提出して下さい。

・Template + Primer + H2O = 10µl となるよう、8連チューブに分注して下さい。
(10µlの反応系でサイクルシークエンスを行いますが、10µlの提出分のうち5µlを使用します。自動分注装置で行っており、チューブの種類によっては完全に吸えないことがあります。以下は5µlx2回分のようなイメージです。)

　ex. pGEM32f(+)、Primer M13の場合

　　　　pGEM32f(+)　200ng/µl, Double-stranded DNA(75ng-150ng目安)
　　　　　/　Primer M13　0.8pmol/µl, Primer(1.6pmol目安)

　▶　( pGEM32f(+) 1.0µl + Primer M13 2.0µl + H2O 2.0µl ) x 2 = 10µl

・施設では、提出頂いた8連チューブに~~BigDye Terminator Reaction kit 0.5µlとx5 Cycle Sequence Buffer 1.5µl~~(保留) を加え、Final volume 10µlとして、サイクルシークエンス反応を行います。
・サンプルの入っているチューブに、前述の例にあるように、申請者のアルファベット3文字と通し番号を付けて提出して下さい。

・TemplateとPrimerの目安は以下の通りです(lifetechnologiesプロトコルより転載)。
・施設で濃度調整等は行いません。

　
・共同利用実験室(301号室)へ持参する

1. サンプルチューブを施設で用意している専用ケースに移し、カバーをする。

2. 専用ケースのカバーに日付、氏名、サンプル数を書いた付箋を貼り、共同利用実験室(301号室)にある冷蔵庫の所定の場所に入れる。

　
　
● サイクルシークエンス反応及び精製について(施設が実施)

・サイクルシークエンス反応はFastで行います(約1時間)。
・試薬及び手技に問題がないか確認するために、毎回pGEM32f(+)(Primer M13)をControl Sampleとして用いています。

・サイクルシークエンス後の精製は低料金サービスの実現のため「エタノール/EDTA/酢酸ナトリウム精製」で行います。そのため、80bp付近にDyeBlobと呼ばれる蛍光色素の残渣が出ますが、その場合は以下のように対処すれば問題ありません。

① Sequence Scanner Softwareの「Analyzed」タブで80bp付近の波形を確認します。
② DyeBlobに隠れている塩基の色を確認して、記録します。
・隠れているDyeBlobと塩基が同色の場合は波形が高くなります。
・図はpGEMのものになりますが、この場合は「GAGTATTC」(74-81bp)と判ります。
③ seq fileをテキストエディタ(Notepad等)で開き、該当部分を修正して保存します。
・1列が80文字なので1列目の右辺りになります。
・今回のケースでは修正の必要はありませんでした。

　
● データについて

・ごく稀にですが、塩基配列解析結果を送付した後に、利用者から「seqファイルが見当たらないので再度送付して下さい」との問い合わせメールを頂きます。
・通常、送られた結果の中にseqファイルが無い場合は、解析結果が思わしくなく、配列として扱うことができなかった場合がほとんどです。その場合は、適切な解析ソフトウェアを使用してクロマト(波形)のファイルを表示すると、原因を明らかにする一助となるかと思われます。

・遺伝子実験施設のHPのContents内に、「13 実験・利用法」というページがあり、その中に「DNAシーケンス波形データ編集ソフトウェアについて」という記事があります。
・MAC OS、WINDOWSに対応したソフトウェアの情報を載せていますので、環境にあったものをご使用下さい。
・WINDOWSであればApplied Biosystems純正のSequence Scanner Softwareが使いやすいと思われます。このソフトウェアを使用すればab1ファイルより波形データを参照することができます(Windows XP以外にもWindows7とWindows10で動作を確認しています)。
・MACでもSequence Scanner Softwareをインストールすることが可能です。詳細は「Mac向けSequence Scanner/Peak Scanner 導入マニュアル2_PlayOnMac_kagoshima-u ver.」を参照して下さい。
・クロマトデータについてご不明な点がありましたら、施設までお気軽にお問い合わせ下さい。
　
　
● 料金等について

DNAシークエンス受託解析料金
(学内利用者)　1サンプル　~~XXX円~~　＊2021年4月料金設定予定

高速冷却遠心機講習会_小テスト_選択式_解説_Q.16-20　＊学内限定

Posted on October 19, 1978 in 遠心分離機

＊画像をクリックするとテキストの該当ページが表示されます。

Q16. ボトルの適正容量について

　p.32

・ボトルには様々な容量がありますが、どのボトルでも適正な容量を守って使用するようにしてください。

・ボトルに適正な容量以上の試料を入れると、過重負荷によりボトルが変形して、破損する恐れがあります。適正な容量はボトルの80%となります。

　
　
Q17. 遠心機のトラブル時における対処法について

・以下に挙げることは高速冷却遠心機を扱う上での基本となります。

　p.34

・1つ目は、遠心開始時は最高回転数に達するまで待つことです。開始直後の3,000rpm〜5,000rpmで、問題が生じやすいです。

・2つ目は、サンプルがリークした場合は、そのまま放置せず、各自で拭き取りと洗浄を行います。

・3つ目は、トラブルが発生したときは速やかに管理室に連絡することです。夜間に使用していたときに発生し、緊急性がある場合は管理室の扉に掲示している携帯番号に連絡するようにしてください。
　
　
Q18. 遠心開始時の対応について

　p.35

・遠心を開始してから最高回転数に達するまでは遠心機の動作を観察するようにして下さい。

・しかしながら、事故に巻き込まれないように、ボタンを押してから最高回転数に達するまでは一歩下がった状態で待つようにします。

　
　
Q19. 遠心機で使用できない溶媒について

　p.37

・ローター本体の材質はアルミニウムになりますので、使用可能な溶媒と使用不可の溶媒があります。

・エタノール、エーテル、エチレングリコール、ヘキサン、ケロシン、メタノール、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、トルエンは化学耐性があるので使用可能です。

・フェノールはアルミニウムとの反応性が高いため使用できません。テトラクロロメタン、クロロホルム、ジクロロメタンは化学反応により爆発の危険性があるため使用できません。
　
　
Q20. 体液や腐食性のサンプルの使用について

　p.38

・超遠心機も含めて、施設が所有する遠心機はすべてバイオハザード仕様ではありません。したがって、体液や感染性のサンプルは使用できません。

・バイオハザード仕様とは、HEPAフィルターをチャンバーの前後に設置して危険性のあるサンプルのエアロゾルを回収するものになります。

・つまり、言い換えると、施設の遠心機で体液や感染性のサンプルを使用すると、エアロゾルが部屋中に拡散されるということになります。

高速冷却遠心機講習会_小テスト_選択式_解説_Q.11-15　＊学内限定

Posted on October 19, 1978 in 遠心分離機

＊画像をクリックするとテキストの該当ページが表示されます。

Q11. 8本架けロータのサンプルの挿入位置について

　p.21,23

・こちらは8本架けであるJA-25.50の例になります。6本の場合はミスは少ないですが、本数を増やすと少し難しくなります。

先ほどと同様、サンプル以外を含めた対角線という視点から考えると、下の図の多くはすぐに不適切であると判ります。

・下の図の右から2番目は最初に説明したように、ローターのバランスをいう点では真ん中の対角線はバランスが取れていますが、サンプル以外の対角線を考えた場合、横が空なので比重が偏ってしまい、回転軸がぶれてしまうことになります。このような場合は、サンプル以外を1つ挟んだ形でサンプルを配置するのが正解となります。
　
　
Q12. 24本架けロータのサンプルの挿入位置について

　p.21,24

・こちらは24本架けのJA-25.15の例になります。数がさらに増えて、複雑になっています。上の図がマニュアルに記載されているものになりますので、あまり特別なことはせず、基本通りに配置するようにして下さい。

・下の図は不適切な例になりますが、左から2番目のように対角線では一見問題ないように見えても、全体のバランスを見た場合に問題があることがあります。

　
　
Q13. ドライブピンのセット方法について

　p.25

・高速冷却遠心機のロータはドライブホールと呼ばれる部分にドライブピンが2本付いています。

・棒のような図は遠心機側になりますが、こちらには山と呼ぶ尖った部分があります。この山にロータのドライブピンが横に来るようにしてセットする形になります。

・山の間にドライブピンを入れることもできますが、そのようにして使用するとドライブピンの消耗が激しくなってしまうので避けてください。2023年9月にドライブピンが破損し、30万円ほどの修理費がかかりました。
　
　
Q14. キャニスタの取り扱いについて

　p.28-29

・JLA-10.500ではロータリッドを必ずつけて遠心することになりますが、JLA-10.500はボトル以外にキャニスターと呼ばれるものが必要となります。したがって、ボトルをそのままではなくて、キャニスターに入れてローターにセットする形になります。

・キャニスターを装着せずボトルだけで遠心するとシャフトが折れて、修理費用に100万円ほどかかります。JLA-8.1000もJLA-10.500と同様でサンプルの本数が少ない場合でもキャニスターは必ず全て装着させます。

・施設には500mlのポリプロピレンボトルを用意していますが、ポリプロピレンボトルの最高回転数は8000rpmまでとなっていますので、注意して下さい。8000rpm以上で回すと変形やサンプルリークを起こす可能性があります。
★上記のトラブル事例は全て過去に利用者が行ったものになります。
　
　
Q15. ボトルの取り扱いについて

　p.30-31

・JLA-8.1000のボトルは、蓋とボトルのところにマークとベントラインと呼ばれる線があるので、この線に合わせる形になります。これよりも手前になってしまうと遠心中に緩んでしまってサンプルリークの原因となるので、十分注意してください。

・施設が所有するJLA-10.500とJLA8.1000のボトルはすべてポリプロピレン製となります。これらのボトルはオートクレーブが可能ですが、蓋はオートクレーブできません。

・JLA8.1000ボトルは2個で6万円ほどしますので、「性質に合わせて適切に使用する」ように注意してください。弱酸、強酸、アルコール、塩基、脂肪族炭化水素、塩は使用可能ですが、アルデヒド、エステル、芳香族・ハロゲン化炭化水素、ケトン、強い酸化剤は使用できません。