遺伝子実験施設４階機器分析室に設置しているVISIONは故障のため使用禁止にしていましたが、２７日に修理が完了しました。
故障の原因は溶媒の析出によるプロポーションバルブの破損によるものです。
これは機器使用後の後片付け（水による洗浄）が十分でない場合起こります。
VISIONの故障の原因のほとんとがこの後片付けの洗浄の不十分によるものです。
この後片付けを徹底するため以下のように使用法を変更します。
解析装置にパスワードを設定しましたので管理者がいないと操作できません。
利用については指導教官の承諾を受け、Webform(e-mail)で申し込みをしてください。申請の受諾後、サンプルをお持ちください。
液状サンプルの場合、バイオブレン処理（前処理 3サイクル 約2時間）が必要です。
両サンプルとも解析は読みたい残基数に3サイクル加えたサイクル数で運転します。
解析時の適正濃度は 数10pM です。それにあわせて濃度調整を行うようにして下さい。
申請時に、
液状サンプルの場合：アプライするサンプルの濃度を記入
PVDF膜サンプルの場合：アプライする膜が吸着している量を記入
して下さい。
許容範囲濃度を超えたサンプルを解析した場合、データの信頼性が損なわれ、次に解析するサンプルへ支障をきたします。
申請時に、液状サンプルの場合はアプライする量を記入してください。
適正なアプライ量は15micro litre以下です。 アプライできる最大量は50micro litreです。
PVDF膜サンプルの場合：アプライする分のみを持参
使用できる溶媒 使用する試薬類はHPLCグレード以上の高純度試薬
酸類： 酢酸、トリフルオロ酸、ギ酸等
アルカリ類： トリメチルアミン、トリエチルアミン等
有機溶媒： アセトニトリル、メタノール、エタノール等
その他： 超純水
＊通常は水溶液 例）0.1％−1.0％酢酸、0.1％TFA、30％アセトニトリル水溶液
使用できない溶媒
不揮発性バッファー類： リン酸塩、トリス、グリシン等
アミノ基をもったもの： トリス、グリシン、アンモニア、アンモニア塩、アンフォライン等
粘度の高いもの・不揮発性のもの： グリセロール、ショ糖等
非イオン性の界面活性剤： Triton、Briji、Tween等
SDS(エドマン分解には直接影響しませんが、コンバージョンフラスコやデリバリーラインに沈着して詰まりの原因になります。)
塩類
＊溶媒交換に透析膜を使用しますと透析膜自体の汚れによってサンプルが汚染されますので使用しないで下さい。
PVDF膜サンプルの場合は下記の方法で十分に脱色（洗浄）し、乾燥させた状態で お持ち下さい(洗浄操作はシークエンスを行う直前にするのが望ましい)。
1) 50％メタノールでボルテックス（３〜４回繰り返して下さい）
2) 100％メタノールでボルテックス（３〜４回繰り返して下さい）
3) 乾燥
1サイクル 1,500円(学内利用の場合)
＊液状サンプルの場合 3サイクル分加算します。
利用については指導教員の承諾を受け、Webformで申し込みを行います。申請の受付後、サンプルをお持ちください。
English version is “here“.
● サービス概要
DNAシークエンス解析サービスは月・水・木の週3回実施しています。
データの送信は通常解析日の翌日(火・木・金)です。
(但し、業務の都合により結果送信が遅れることもあります)
・ABI3500xl Genetic Analyzer(キャピラリー24本タイプ)を使用します。
・約2.3時間の泳動で約800塩基(シークエンス反応が良好の場合)読むことができます。
・泳動操作はすべて施設スタッフが行います。
・申請は Webform をご利用ください(学内のみアクセス可能)。
・要領に従い必要事項を記入し、確認ボタンを押してください。情報を確認後、送信を押すと管理室にe-mailが送信されます。
・解析を開始する予定日時をお知らせします。
・予定日時に合わせてサンプルをお持ちください。
・解析終了後、e-mailでデータを圧縮後添付して送信します。
解析の順番は先着順となります。申請の受付後、改めてe-mailにより連絡をします。解析日の指定はできません。
申請→予定日確認→提出 の流れを守ってください。
● DNAサンプルの調製について
・各自の実験室での処理
エタノール沈殿による精製+脱イオンホルムアミド溶解で20μl以上の溶解溶液が、BigDyeX Terminaterによる精製で20µl以上の上澄み溶液が必要です。この量は推奨であり、時間の経過とともに蒸発することがありますので、余裕を持った容量で提出してください。
＊2016年3月 BigDyeX Terminater精製の上澄み量を変更(40µl以上 → 20µl以上)
また、エタノール沈殿+ホルムアミド溶解による方法の場合、溶解後は2日間程度経つと蛍光強度の低下が見られるようになります。BigDyeX Terminator精製法による場合は室温で2日間、冷蔵で10日間程度保存可能です。いずれの場合もアルミホイル等で遮光した容器内で保存してください。
・共同利用実験室(301号室)へ持参する
1. チューブにサンプル名を書き、施設で用意している専用ケースにサンプルチューブを移し、カバーをする。
＊チューブのネーミングではミスを未然に防ぐため、他の人のサンプルと区別がつくように記入してください。また、連番の数字は末尾に付けてください。
(EX. 1,2,3…のみのネーミングの場合、他の人と区別が難しい)
2. 専用ケースのカバーに日付、氏名、サンプル数を書いた付箋を貼り、共同利用実験室(301号室)にある冷蔵庫の所定の場所に入れる。
● データについて
・ごく稀にですが、塩基配列解析結果を送付した後に、利用者から「seqファイルが見当たらないので再度送付してください」との問い合わせメールを頂きます。
・通常、送られた結果の中にseqファイルが無い場合は、解析結果が不良で、配列として扱うことができなかった場合がほとんどです。その場合は、適切な解析ソフトウェアを使用してクロマト(波形)のファイルを表示すると、原因を明らかにする一助となるかと思われます。
・遺伝子実験施設のHPに、「13 実験・利用法」というページがあり、その中に「DNAシーケンス波形データ編集ソフトウェアについて」という記事があります。
・MAC OS、Windowsに対応したソフトウェアの情報を載せていますので、自身のPC環境にあったものをご使用ください。
・WindowsであればLifetechnologies社のSequence Scanner Softwareが使いやすいと思われます。このソフトウェアを使用すればab1ファイルより波形データを参照することができます(Windows XP以外にもWindows7とWindows10で動作を確認しています)。
・MACでもSequence Scanner Softwareをインストールすることが可能です。詳細は「Mac向けSequence Scanner/Peak Scanner 導入マニュアル2_PlayOnMac_kagoshima-u ver.」を参照してください。
・クロマトデータについてご不明な点がありましたら、施設までお気軽にお問い合わせください。
● DNAシーケンス料金等について
解析料金：「こちら」をご参照ください。
消耗品分譲価格：「こちら」をご参照ください。
○ シークエンシングキット BigDye Terminator v3.1(Life technologies)
・×5 Sequence buffer(75µl)が1本付いてきます(2本目から有償)。
○ Hi-Di Formamide(500μL）
○ 精製キット BigDyeX Terminator(Life technologies)
価格はいずれも学内利用者の場合です。詳細は管理室までお問い合わせください。
● DNAシーケンス関連情報
DNAシーケンスに関する有益な資料や情報をホームページで公開しています。ご活用ください。
「こちら」をご参照ください。
